Plasmide CRISPR d'Activation (m) DEPTOR: sc-430194-ACT

Deptor code pour DEPTOR, une protéine d’échafaudage contenant un domaine DEP qui se lie aux complexes mTOR et en module l’activité, influençant les voies de signalisation de mTORC1 comme de mTORC2. Par son impact sur la détection des nutriments, la synthèse protéique, l’autophagie et la régulation du cytosquelette, DEPTOR contribue à ajuster la croissance cellulaire et l’adaptation métabolique. Une expression altérée de DEPTOR a été associée à une dérégulation de l’activité de la voie mTOR dans des contextes tels que la biologie des cancers, la signalisation de l’insuline et la fonction des cellules immunitaires, ce qui en fait un nœud utile pour étudier les rétrocontrôles de la voie et les réponses au stress. Dans des modèles murins, Deptor constitue un point d’entrée pratique pour analyser comment l’architecture du réseau mTOR façonne la prolifération, la différenciation et l’homéostasie tissulaire.

DEPTOR Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Deptor sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DEPTOR Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Deptor dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Deptor, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DEPTOR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Deptor natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DEPTOR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DEPTOR dans les cellules tumorales présentant une expression de Deptor silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.