DEC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402058-ACT

BHLHE40 kodiert den basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor DEC1, einen kontextabhängigen Regulator der Genexpression, der Umweltsignale wie Hypoxie und zirkadiane Signale integriert. DEC1 moduliert Transkriptionsprogramme, die mit Zellzyklus-Kontrolle, Differenzierung, epithelial-mesenchymaler Transition und metabolischer Anpassung verknüpft sind, und steht in Wechselwirkung mit Signalwegen wie der HIF-1-Signalkaskade und den Kernnetzwerken der zirkadianen Uhr. Über diese Funktionen trägt DEC1 zur Regulation von Stressantworten und der Expression entzündungsbezogener Gene bei; in verschiedenen experimentellen Systemen wurden Zusammenhänge mit Tumorbiologie, fibroseassoziiertem Remodeling und Immun-Dysregulation beschrieben.

DEC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BHLHE40-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DEC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BHLHE40-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BHLHE40-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DEC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BHLHE40-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DEC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DEC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BHLHE40-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.