DDEF2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403676-ACT

O ASAP2 humano (também conhecido como DDEF2) codifica uma proteína ativadora de GTPase de ARF que se localiza em adesões focais e interage com a sinalização mediada por integrinas para coordenar a remodelação de actina, a adesão celular e a migração direcional. Ao regular pequenas GTPases da família ARF, o DDEF2 influencia o tráfego de membranas e a dinâmica do citoesqueleto, moldando o espalhamento celular e o comportamento invasivo. Esses processos conectam a atividade de ASAP2/DDEF2 a vias frequentemente investigadas na transformação oncogênica, na motilidade associada à metástase e em outros distúrbios que envolvem adesão aberrante e remodelação tecidual. Assim, o ASAP2 é frequentemente estudado em contextos como a renovação de adesões focais, a endocitose e a comunicação cruzada de sinalização entre as redes de ARF e da família Rho.

DDEF2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ASAP2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDEF2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ASAP2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ASAP2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDEF2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ASAP2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDEF2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDEF2 em células tumorais com expressão de ASAP2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.