DDB2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401686-ACT

Das humane DDB2 kodiert einen Faktor zur Erkennung von DNA-Schäden, der zusammen mit DDB1 den UV-DDB-Komplex bildet und stromaufwärts der CUL4A–RBX1-E3-Ubiquitin-Ligase wirkt, um die Nukleotidexzisionsreparatur des gesamten Genoms (Global Genome Nucleotide Excision Repair, GG-NER) zu initiieren. Durch die Bindung an UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidindimere und 6-4-Photoprodukte fördert DDB2 die Verifizierung der Läsion, das Chromatin-Remodeling und die Rekrutierung nachgeschalteter NER-Komponenten und unterstützt so die Genomstabilität sowie Zellzyklus-Checkpoint-Antworten. Die DDB2-Aktivität überschneidet sich mit ubiquitinvermittelter Proteostase und transkriptionsgekoppelten DNA-Reparaturwegen und beeinflusst dadurch die zelluläre Sensitivität gegenüber genotoxischem Stress. Eine veränderte Regulation von DDB2 wurde mit einer verminderten DNA-Reparaturkapazität und der Anhäufung von Mutationen in Zusammenhang gebracht, was für die Krebsbiologie und photosensitivitätsassoziierte Phänotypen relevant ist und DDB2 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien der DNA-Schadenssignalgebung macht.

DDB2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDB2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DDB2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDB2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDB2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DDB2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDB2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DDB2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DDB2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDB2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.