Plasmide CRISPR d'Activation (h) DDB1: sc-402067-ACT

Le gène humain **DDB1** code la protéine 1 de liaison à l’ADN endommagé, un adaptateur central des complexes de ligase E3 à ubiquitine **CUL4–DDB1** qui coordonnent le renouvellement, dépendant de l’ubiquitine, de facteurs associés à la chromatine. DDB1 participe à la réparation par excision de nucléotides et, plus largement, au maintien du génome en couplant la reconnaissance des dommages induits par les UV au remodelage de la chromatine, aux réponses au stress réplicatif et à la protéostase au niveau des fourches réplicatives bloquées. En régulant la progression du cycle cellulaire et la capacité de réparation de l’ADN, une activité altérée de DDB1 peut influencer l’instabilité génomique et des programmes transcriptionnels associés à la transformation oncogénique et à d’autres troubles prolifératifs. Sa position centrale dans la signalisation par l’ubiquitine fait de DDB1 un nœud pertinent pour étudier le choix des voies de réparation de l’ADN, la dynamique de la chromatine couplée à la réplication et le remodelage adaptatif de l’épigénome en réponse au stress.

DDB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDB1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDB1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDB1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DDB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.