DDB1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402067-ACT

O DDB1 humano codifica a proteína 1 de ligação a danos no DNA, um adaptador central dos complexos de ligase E3 de ubiquitina CUL4–DDB1 que coordenam a degradação, dependente de ubiquitina, de fatores associados à cromatina. O DDB1 participa do reparo por excisão de nucleotídeos e da manutenção mais ampla do genoma ao acoplar o reconhecimento de danos por UV à remodelação da cromatina, às respostas ao estresse de replicação e à proteostase em forquilhas de replicação estagnadas. Por meio da regulação da progressão do ciclo celular e da capacidade de reparo do DNA, alterações na atividade de DDB1 podem influenciar a instabilidade genômica e programas transcricionais ligados à transformação oncogênica e a outros distúrbios proliferativos. Sua posição central na sinalização por ubiquitina torna o DDB1 um ponto útil para estudar a escolha de vias de reparo do DNA, a dinâmica da cromatina acoplada à replicação e a remodelação adaptativa do epigenoma em resposta ao estresse.

DDB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DDB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DDB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DDB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDB1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DDB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDB1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDB1 em células tumorais com expressão de DDB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.