Cytokeratin 5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400671-ACT

KRT5 kodiert Zytokeratin 5, ein Intermediärfilament-Protein vom Typ II, das mit Keratin 14 ein Paar bildet und so das basale Keratinnetzwerk in mehrschichtigen Epithelien aufbaut. Zytokeratin 5 trägt zur mechanischen Stabilität, zur Architektur der Zell‑Zell‑Adhäsion und zu epithelialen Stressantworten bei und wird während der Keratinozytendifferenzierung, der Wundheilung und der Aufrechterhaltung des basalen Zellschicksals dynamisch reguliert. Eine veränderte KRT5-Expression oder eine gestörte Organisation der Keratinfilamente ist mit Phänotypen epithelialer Fragilität assoziiert und wird in Studien zu basalartigen epithelialen Programmen und Tumor‑Linienzuständen häufig untersucht. Als struktureller Knotenpunkt steht Zytokeratin 5 in funktioneller Wechselwirkung mit der Umgestaltung des Zytoskeletts sowie mit adhäsionsgekoppelten Signalwegen, die Proliferation und Barriereintegrität beeinflussen.

Cytokeratin 5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KRT5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cytokeratin 5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KRT5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KRT5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cytokeratin 5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KRT5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cytokeratin 5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cytokeratin 5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KRT5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.