Cytokeratin 5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400671-ACT

KRT5 codifica a citoqueratina 5, uma proteína de filamento intermediário do tipo II que se emparelha com a queratina 14 para formar a rede de queratinas basais em epitélios estratificados. A citoqueratina 5 contribui para a estabilidade mecânica, a arquitetura de adesão célula–célula e as respostas do epitélio ao estresse, sendo regulada dinamicamente durante a diferenciação de queratinócitos, o reparo de feridas e a manutenção do destino de células basais. Alterações na expressão de KRT5 ou na organização dos filamentos de queratina estão associadas a fenótipos de fragilidade epitelial e são frequentemente avaliadas em estudos de programas epiteliais do tipo basal e de estados de linhagem tumoral. Como um núcleo estrutural, a citoqueratina 5 se integra funcionalmente ao remodelamento do citoesqueleto e a vias de sinalização ligadas à adesão, que influenciam a proliferação e a integridade da barreira.

Cytokeratin 5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 5 em células tumorais com expressão de KRT5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.