Plásmido CRISPR de Activación (h) CYP8B1: sc-403383-ACT

El gen humano CYP8B1 codifica la esterol 12α-hidroxilasa, una enzima microsomal del citocromo P450 que determina la composición de los ácidos biliares al catalizar un paso clave de hidroxilación necesario para la síntesis de ácido cólico. A través de su papel en la vía clásica de biosíntesis de ácidos biliares, CYP8B1 influye en la proporción ácido cólico/ácido quenodesoxicólico, modulando así el recambio hepático de colesterol, la absorción intestinal de lípidos y la señalización mediada por ácidos biliares. La actividad de CYP8B1 está vinculada funcionalmente a la homeostasis metabólica mediante el diálogo cruzado con vías de receptores nucleares como FXR y programas transcripcionales relacionados que controlan el transporte de ácidos biliares y la regulación por retroalimentación. La alteración de la expresión de CYP8B1 o de los perfiles de ácidos biliares se ha asociado con dislipidemia, resistencia a la insulina, enfermedad del hígado graso no alcohólico y fenotipos hepáticos colestásicos, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos del metabolismo hepatobiliar.

CYP8B1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CYP8B1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CYP8B1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CYP8B1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CYP8B1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CYP8B1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CYP8B1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CYP8B1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CYP8B1 en células tumorales con expresión de CYP8B1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.