CYP7A1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419932-ACT

Maus-Cyp7a1 kodiert die Cholesterin-7α-Hydroxylase (CYP7A1), ein leberreich exprimiertes Cytochrom-P450-Enzym, das den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des klassischen Gallensäuresynthesewegs aus Cholesterin katalysiert. Durch die Kontrolle der Umwandlung von Cholesterin in 7α-Hydroxycholesterin prägt CYP7A1 Größe und Zusammensetzung des Gallensäurepools und beeinflusst damit die enterohepatische Signalübertragung über FXR/FGF15 sowie die nachgeschaltete Regulation des Lipid-, Glukose- und Energiestoffwechsels. Die Cyp7a1-Aktivität verknüpft die hepatische Cholesterinhomöostase mit gallensäureabhängigen Transkriptionsprogrammen und überschneidet sich mit Netzwerken des Lipoproteinstoffwechsels und der Xenobiotika-Verarbeitung. Eine fehlregulierte CYP7A1-Expression wird häufig im Zusammenhang mit Hypercholesterinämie, Fettleber-Phänotypen und Modellen metabolischer Entzündung untersucht, in denen die Gallensäuresignalgebung gestört ist.

CYP7A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cyp7a1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP7A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cyp7a1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cyp7a1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP7A1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cyp7a1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP7A1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP7A1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cyp7a1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.