cyclin D3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400634-ACT

CCND3 kodiert Cyclin D3, ein regulatorisches Cyclin, das mit CDK4/6 einen Komplex bildet, um Proteine der RB-Familie zu phosphorylieren und so den Zellzyklus-Übergang von G1 nach S zu fördern. Über die Kontrolle der E2F-abhängigen Transkription und die Integration mitogener Signale trägt Cyclin D3 dazu bei, Proliferation mit Differenzierungsprogrammen in hämatopoetischen und lymphoiden Linien zu koordinieren. Eine fehlregulierte CCND3-Expression oder -Aktivität wurde mit veränderter Zellzykluskontrolle in Verbindung gebracht und ist an onkogenen Signalzusammenhängen beteiligt, in denen die Cyclin‑D–CDK-Aktivität erhöht ist. Entsprechend wird CCND3 breit in Signalwegen untersucht, die Proliferation, Checkpoint-Regulation und linienspezifische Wachstumskontrolle steuern.

cyclin D3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCND3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cyclin D3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCND3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCND3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cyclin D3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCND3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cyclin D3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cyclin D3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCND3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.