CSN8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430844-ACT

Mouse Cops8 kodiert CSN8, eine zentrale Untereinheit des COP9-Signalosoms, das die Aktivität von Cullin-RING-Ubiquitin-Ligasen durch die Regulation des Neddylierungsstatus von Cullinen koordiniert. Durch die Feinabstimmung der ubiquitinabhängigen Proteostase beeinflusst CSN8 die Zellzyklusprogression, DNA-Schadensantworten und stressadaptive Signalprogramme, die sich mit Autophagie- und Entzündungswegen überschneiden. Eine veränderte Funktion des COP9-Signalosoms wurde in Modellen der Gewebehomöostase sowie bei neurodegenerativen und onkogenen Prozessen mit einer fehlregulierten Proteinumsatzkontrolle und Transkriptionssteuerung in Verbindung gebracht. Cops8 wird daher häufig eingesetzt, um zu untersuchen, wie die Dynamik des Ubiquitin-Proteasom-Systems die Signaltreue und die zelluläre Lebensfähigkeit in vivo und in kultivierten Mauszellen prägt.

CSN8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cops8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CSN8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cops8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cops8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CSN8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cops8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CSN8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CSN8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cops8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.