CRX CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401736-ACT

CRX (Cone-Rod Homeobox) kodiert einen photorezeptorspezifischen Homeodomänen-Transkriptionsfaktor, der die Entwicklung der Retina sowie die Aufrechterhaltung der Stäbchen- und Zapfenidentität koordiniert. Im Zellkern bindet CRX an cis-regulatorische Elemente, um Transkriptionsprogramme zu steuern, die Phototransduktion, die Biogenese der Außensegmente und synaptische Funktionen regulieren, und wirkt dabei gemeinsam mit anderen retinalen Regulatoren wie NRL und OTX2. Eine strenge Kontrolle CRX-abhängiger Gennetzwerke ist für das Überleben der Photorezeptoren und die Sehfunktion essenziell. Genetische Veränderungen in CRX und seinen nachgeschalteten Zielgenen werden mit erblichen retinalen Degenerationen in Verbindung gebracht, darunter Retinitis pigmentosa, Zapfen-Stäbchen-Dystrophie und die kongenitale Amaurose nach Leber, was CRX zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien der retinalen Genregulation macht.

CRX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CRX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CRX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CRX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CRX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.