CRX Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401736-ACT

CRX (cone-rod homeobox) codifica um fator de transcrição com homeodomínio específico de fotorreceptores, que orquestra o desenvolvimento da retina e a manutenção da identidade de bastonetes e cones. No núcleo, o CRX liga-se a elementos cis-regulatórios para controlar programas transcricionais que regem a fototransdução, a biogênese do segmento externo e a função sináptica, atuando em conjunto com outros reguladores retinianos, como NRL e OTX2. A regulação rigorosa das redes gênicas dependentes de CRX é essencial para a sobrevivência dos fotorreceptores e para a função visual. Alterações genéticas em CRX e em seus alvos a jusante estão associadas a degenerações retinianas hereditárias, incluindo retinose pigmentar, distrofia cone-bastonete e amaurose congênita de Leber, tornando o CRX um nó central para estudos mecanísticos da regulação gênica na retina.

CRX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRX sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CRX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRX em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRX, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CRX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRX nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CRX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CRX em células tumorais com expressão de CRX silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.