Plasmide CRISPR d'Activation (h) CrkRS: sc-402238-ACT

Le CDK12 humain code une kinase dépendante des cyclines qui s’associe à la cycline K pour phosphoryler le domaine C-terminal (CTD) de l’ARN polymérase II, coordonnant l’élongation de la transcription avec la maturation co‑transcriptionnelle de l’ARN. CDK12 est particulièrement important pour maintenir l’expression de gènes longs et complexes impliqués dans la réponse aux dommages de l’ADN, la tolérance au stress de réplication et le maintien de la stabilité du génome, ce qui le relie aux réseaux de recombinaison homologue et de signalisation des points de contrôle. Une perturbation de la fonction de CDK12 modifie les programmes transcriptionnels qui gouvernent la progression du cycle cellulaire et le choix des voies de réparation, avec des effets en aval sur l’intégrité chromosomique et la fitness cellulaire. En recherche biomédicale, CDK12 est souvent étudié dans le contexte d’un couplage transcription–réparation dérégulé et de son association avec des phénotypes d’instabilité génomique observés dans de multiples modèles de maladie.

CrkRS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDK12 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CrkRS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDK12 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDK12, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CrkRS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDK12 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CrkRS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CrkRS dans les cellules tumorales présentant une expression de CDK12 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.