Plasmide CRISPR d'Activation (h) CRB3: sc-403145-ACT

CRB3 (crumbs homolog 3) code une protéine de polarité apicale qui se localise dans des complexes associés aux jonctions serrées et contribue à l’organisation de l’architecture des cellules épithéliales. En soutenant la polarité apico-basale, l’intégrité des jonctions et le trafic vésiculaire, CRB3 participe à des processus tels que la formation de la lumière, la ciliogenèse et la prolifération régulée via des réseaux de signalisation associés à la polarité. Des altérations de l’expression ou de la localisation de CRB3 ont été associées à une perte de l’organisation épithéliale et à une perturbation de l’homéostasie tissulaire, des caractéristiques fréquemment étudiées dans les travaux sur la progression tumorale et les métastases. En tant que déterminant de polarité conservé, CRB3 est largement utilisé comme outil moléculaire pour explorer la différenciation épithéliale et la fonction barrière dans des modèles cellulaires humains.

CRB3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRB3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CRB3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRB3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRB3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CRB3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRB3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CRB3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CRB3 dans les cellules tumorales présentant une expression de CRB3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.