COP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402776-ACT

O RFWD2 codifica a COP1, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING que regula a estabilidade proteica ao catalisar a ubiquitinação e a degradação proteassomal de múltiplos reguladores de sinalização e de transcrição. A COP1 influencia programas celulares, incluindo respostas a danos no DNA, progressão do ciclo celular e transcrição adaptativa ao estresse, ao modular a abundância e a atividade de efetores de vias de sinalização. Por meio do seu controle da proteostase dependente de ubiquitina, a COP1 pode remodelar redes transcricionais relevantes para a sinalização oncogênica, a diferenciação e a homeostase celular. A expressão ou atividade desregulada de COP1 tem sido associada a alterações no equilíbrio entre supressores tumorais e oncogenes, tornando o RFWD2 um ponto útil para estudos mecanísticos da biologia de doenças ligada à via da ubiquitina.

COP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RFWD2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

COP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RFWD2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RFWD2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de COP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RFWD2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de COP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via COP1 em células tumorais com expressão de RFWD2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.