Plasmide CRISPR d'Activation (m) COL4A3: sc-419745-ACT

Le gène murin Col4a3 code la chaîne α3 du collagène de type IV (COL4A3), un composant structurel central des membranes basales, qui s’assemble en un réseau hétérotrimérique α3α4α5(IV). Cette charpente de matrice extracellulaire soutient l’intégrité des membranes basales glomérulaire et tubulaire, influence l’adhérence cellule–matrice et la mécanotransduction, et façonne l’architecture tissulaire via des interactions avec les laminines, les intégrines et des enzymes de remodelage de la matrice. COL4A3 est étroitement associé aux voies d’organisation des membranes basales et d’homéostasie de la matrice extracellulaire, importantes pour la fonction de la barrière de filtration rénale. La dérégulation ou la perturbation génétique de Col4a3 est largement utilisée pour modéliser des maladies héréditaires des membranes basales présentant une pathologie rénale progressive et des phénotypes de remodelage tissulaire associés, in vivo et dans des systèmes d’organoïdes.

COL4A3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Col4a3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COL4A3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Col4a3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Col4a3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COL4A3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Col4a3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COL4A3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COL4A3 dans les cellules tumorales présentant une expression de Col4a3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.