Plásmido CRISPR de Activación (m) COL4A3: sc-419745-ACT

El gen Col4a3 de ratón codifica la cadena α3 del colágeno tipo IV (COL4A3), un componente estructural central de las membranas basales que se ensambla en la red heterotrimérica α3α4α5(IV). Este armazón de la matriz extracelular sostiene la integridad de las membranas basales glomerular y tubular, influye en la adhesión célula–matriz y en la mecanotransducción, y modela la arquitectura tisular mediante interacciones con lamininas, integrinas y enzimas de remodelación de la matriz. COL4A3 está estrechamente vinculado a la organización de la membrana basal y a las vías de homeostasis de la matriz extracelular, importantes para la función de la barrera de filtración renal. La desregulación o la alteración genética de Col4a3 se utiliza ampliamente para modelar trastornos hereditarios de la membrana basal con patología renal progresiva y fenotipos asociados de remodelación tisular, tanto in vivo como en sistemas de organoides.

COL4A3 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Col4a3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

COL4A3 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Col4a3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Col4a3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de COL4A3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Col4a3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de COL4A3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía COL4A3 en células tumorales con expresión de Col4a3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.