CNK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403355-ACT

CNKSR1 kodiert CNK1, ein multidomäniges Scaffold-Protein, das die Signalweiterleitung von Rezeptor-Tyrosinkinasen zur RAS–RAF–MEK–ERK-Kaskade und zu weiteren MAPK-abhängigen Programmen koordiniert. Durch die Organisation von Komplexen, die RAF-Kinasen, Regulatoren des RAS-Signalwegs und zytoskelettale Komponenten enthalten, beeinflusst CNK1 Proliferation, Differenzierung und die Zellmorphologie und kann das Crosstalk mit der PI3K/AKT-Signalgebung modulieren. Die Funktion von CNK1 wurde mit einer kontextabhängigen Kontrolle der onkogenen RAS-Signalgebung in Verbindung gebracht; veränderte Expression oder eine veränderte Kopplung an Signalwege wurden in mehreren Krebsmodellen beschrieben. Diese Eigenschaften machen CNKSR1 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um die Verschaltung von Signalwegen, Feedback-Regulation und scaffoldvermittelte Signalspezifität in menschlichen Zellen zu untersuchen.

CNK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CNKSR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CNK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CNKSR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CNKSR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CNK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CNKSR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CNK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CNK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CNKSR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.