CLN1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404018-ACT

PPT1 codifica a palmitoil-proteína tioesterase 1 (CLN1), uma enzima lisossomal despalmitoilante que remove grupos de ácidos graxos ligados por tioéster de proteínas S-aciladas, favorecendo sua renovação e seu tráfego. Ao regular a proteostase lisossomal e a degradação de proteínas modificadas por lipídios, a CLN1 influencia a dinâmica endolisossomal, a função do eixo autofagia–lisossomo e a homeostase neuronal. A perda da atividade de PPT1 está associada à lipofuscinose ceróide neuronal (doença CLN1), caracterizada pelo acúmulo de material de armazenamento autofluorescente e por neurodegeneração progressiva. Assim, PPT1/CLN1 é amplamente estudada na biologia dos lisossomos, no controle de qualidade proteica e nos mecanismos de doenças neurodegenerativas de armazenamento.

CLN1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CLN1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CLN1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CLN1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CLN1 em células tumorais com expressão de PPT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.