CLK2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403326-ACT

Humanes CLK2 (CDC-like kinase 2) ist eine dualspezifische Proteinkinase, die SR-reiche Spleißfaktoren phosphoryliert und die Dynamik des Spleißosoms koordiniert, wodurch die prä-mRNA-Verarbeitung mit der transkriptionellen Kontrolle verknüpft wird. Die CLK2-Aktivität trägt zu Programmen des alternativen Spleißens bei und steht in Wechselwirkung mit der Zellzyklusregulation sowie stressresponsiven Signalwegen, einschließlich Pfaden, die den RNA-Stoffwechsel und die Proteostase beeinflussen. Eine dysregulierte CLK2-Expression oder -Signalgebung wurde mit veränderten Spleißmustern in der Krebsbiologie und im Kontext metabolischer Erkrankungen in Verbindung gebracht, was CLK2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der RNA-Prozessierung macht. Als regulatorische Kinase bietet CLK2 einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um zu untersuchen, wie phosphorylierungsabhängige Spleißentscheidungen nachgelagerte Genexpressionsnetzwerke umgestalten.

CLK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLK2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLK2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLK2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.