Plasmide CRISPR d'Activation (h) CLASP1: sc-404219-ACT

CLASP1 (cytoplasmic linker associated protein 1) est une protéine se liant à l’extrémité « plus » des microtubules, qui stabilise et organise les réseaux de microtubules au niveau du cortex cellulaire et des kinétochores, en coordonnant l’assemblage du fuseau, l’alignement des chromosomes et leur ségrégation fidèle au cours de la mitose. Grâce à des interactions avec les protéines EB, les protéines CLIP et des facteurs associés aux kinétochores, CLASP1 favorise le « sauvetage » des microtubules et leur instabilité dynamique, essentiels à la polarité cellulaire, au trafic intracellulaire et à la migration dirigée. La perturbation des dynamiques des microtubules régulées par CLASP1 peut favoriser des erreurs mitotiques et l’aneuploïdie, reliant ainsi sa fonction à des voies largement impliquées dans le contrôle de la prolifération et la stabilité du génome. En conséquence, CLASP1 est fréquemment étudiée dans des travaux sur la régulation du cytosquelette, la progression du cycle cellulaire et les mécanismes reliant le comportement des microtubules à la transformation cellulaire et aux réponses au stress.

CLASP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CLASP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CLASP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CLASP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CLASP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CLASP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CLASP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CLASP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CLASP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de CLASP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.