CKIP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403898-ACT

PLEKHO1 kodiert das mit Casein-Kinase 2 interagierende Protein 1 (CKIP-1), ein Adapterprotein mit Pleckstrin-Homologie-Domäne, das an der Plasmamembran lokalisiert und Protein-Protein-Interaktionen koordiniert, die Signaltransduktion und Proteinumsatz steuern. CKIP-1 wird über Interaktionen mit E3-Ligasen und Phosphatasen mit der Regulation der Akt/PI3K-Signalgebung sowie ubiquitinabhängigen Prozessen in Verbindung gebracht und beeinflusst dadurch Zellwachstum, Differenzierung und die Organisation des Zytoskeletts. In der Knochenbiologie ist CKIP-1 an der Funktion von Osteoblasten und Signalwegen der Knochenbildung beteiligt, während umfassendere Studien eine veränderte PLEKHO1-Expression mit Veränderungen in Proliferations- und Stressantwort-Programmen assoziieren, die in onkologischen und entzündlichen Kontexten relevant sind. Diese Eigenschaften machen PLEKHO1 zu einem nützlichen Ziel, um membrannahe Signalnetzwerke und transkriptionelle Programme zu untersuchen, die der Gewebehomöostase zugrunde liegen.

CKIP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PLEKHO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CKIP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PLEKHO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PLEKHO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CKIP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PLEKHO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CKIP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CKIP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PLEKHO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.