CENP-F CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430783-ACT

Cenpf kodiert CENP-F, ein großes, coiled-coil-haltiges, kinetochorassoziiertes Protein, das sich von der späten G2-Phase bis in die Mitose anreichert und die Chromosomenausrichtung, die Signalgebung des Spindelkontrollpunkts sowie die korrekte Trennung der Schwesterchromatiden koordiniert. CENP-F trägt zur Dynamik der Mikrotubuli–Kinetochor-Anheftung bei und ist in zellzyklusregulatorische Netzwerke integriert, die den mitotischen Verlauf und die Zytokinese steuern. Eine fehlregulierte Expression oder Funktion von CENP-F ist mit chromosomaler Instabilität und aberranter Proliferation verknüpft, wodurch Cenpf ein hilfreicher Knotenpunkt für die Untersuchung aneuploidieassoziierter Mechanismen in der Krebsbiologie und bei Entwicklungsstörungen ist. In Mausmodellen ermöglicht eine Störung von Cenpf mechanistische Analysen der Mitosekontrolle, der Genomstabilität und der gewebespezifischen Homöostase, die von Zellteilungen abhängt.

CENP-F Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cenpf-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CENP-F Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cenpf-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cenpf-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CENP-F-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cenpf-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CENP-F-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CENP-F-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cenpf-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.