Cdk8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-435217-ACT

Cyclin-abhängige Kinase 8 (Cdk8) ist eine mit dem Mediator-Komplex assoziierte Kinase, die die von RNA-Polymerase II abhängige Transkription reguliert, indem sie Signaleingänge mit der Aktivität von Promotoren und Enhancern verknüpft. In Mauszellen moduliert CDK8 Transkriptionsprogramme stromabwärts von Signalwegen wie Wnt/β-Catenin, TGF-β und MAPK und prägt dadurch Proliferation, Differenzierung sowie die stressresponsive Genexpression. Durch die Phosphorylierung transkriptioneller Regulatoren und von Mediator-Untereinheiten beeinflusst CDK8 die Zellzykluskontrolle und Schicksalsentscheidungen von Zelllinien während der Entwicklung und der Gewebehomöostase. Eine fehlregulierte CDK8-Aktivität wurde mit veränderten Transkriptionszuständen in Verbindung gebracht, die mit onkogenem Signaling und entzündlichen Prozessen assoziiert sind, was CDK8 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Genregulation und des Signalweg-Crosstalks macht.

Cdk8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cdk8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdk8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cdk8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cdk8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdk8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cdk8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdk8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdk8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cdk8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.