Cdk5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419602-ACT

A quinase 5 dependente de ciclina (Cdk5) é uma quinase de serina/treonina direcionada à prolina que, ao contrário das CDKs do ciclo celular, é ativada principalmente em células pós-mitóticas por meio da associação com p35/p39 e regula o desenvolvimento e a função neuronais. Em camundongos, a Cdk5 controla a dinâmica do citoesqueleto, o direcionamento axonal, o tráfego de vesículas sinápticas e a sinalização dependente de atividade ao fosforilar substratos que modulam a estabilidade dos microtúbulos, a endocitose e respostas transcricionais. Ela interage com vias que governam a sinalização de cálcio, cascatas de quinases e a proteostase, integrando sinais que moldam a morfologia neuronal e a plasticidade das redes. A desregulação da atividade da Cdk5 tem sido associada a mecanismos relevantes para a neurodegeneração, a neuroinflamação e fenótipos neuropsiquiátricos, o que a torna um alvo frequente em estudos de respostas neuronais ao estresse e de disfunção em nível de circuitos.

Cdk5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cdk5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdk5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cdk5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cdk5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdk5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cdk5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdk5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdk5 em células tumorais com expressão de Cdk5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.