Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cdc50A: sc-403231-ACT

TMEM30A code la sous-unité humaine Cdc50A des complexes flippases de phospholipides P4‑ATPase, qui maintiennent l’asymétrie des phospholipides de la membrane plasmique en transloquant des aminophospholipides à travers les bicouches. En soutenant le trafic vésiculaire, l’endocytose et le recyclage des protéines membranaires, Cdc50A influence la polarité cellulaire, la signalisation apoptotique liée à l’exposition de la phosphatidylsérine, ainsi que les microdomaines de signalisation dépendants des lipides. La perturbation de l’homéostasie lipidique dépendante de TMEM30A/Cdc50A a été associée à une modification du renouvellement des récepteurs, à des réponses inflammatoires et à des phénotypes de stress cellulaire pertinents pour la neurobiologie, l’immunité et le remodelage membranaire associé au cancer. Ces fonctions font de Cdc50A un point d’entrée utile pour étudier l’asymétrie membranaire, les voies de trafic et les réseaux de signalisation régulés par les lipides dans les cellules humaines.

Cdc50A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEM30A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cdc50A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEM30A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEM30A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cdc50A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEM30A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cdc50A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cdc50A dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEM30A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.