CD73 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423919-ACT

O gene Nt5e do camundongo codifica a CD73 (ecto-5′-nucleotidase), uma enzima de superfície celular ancorada por GPI que hidrolisa AMP extracelular em adenosina, modulando a sinalização purinérgica e o equilíbrio entre sinais pró-inflamatórios mediados por ATP/AMP e a imunomodulação mediada por adenosina. A atividade da CD73 influencia a função de barreira vascular e epitelial, o tráfego de leucócitos e programas de proteção tecidual por meio de vias de receptores de adenosina e de sinalização associada ao cAMP. No microambiente tumoral e em tecidos com inflamação crônica, o eixo CD39–CD73 pode contribuir para imunossupressão metabólica, remodelamento estromal alterado e prejuízo da imunidade antitumoral, tornando Nt5e um alvo frequente em estudos de biologia do câncer, autoimunidade e fibrose. Como ectoenzima de superfície, a CD73 também é usada para investigar transições de estado celular e o controle, pelo microambiente, de fenótipos imunes e endoteliais.

CD73 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Nt5e sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD73 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Nt5e em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Nt5e, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD73. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Nt5e nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD73 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD73 em células tumorais com expressão de Nt5e silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.