Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD73: sc-400307-ACT

NT5E code pour CD73 (ecto-5′-nucléotidase), une ectoenzyme ancrée par GPI qui hydrolyse l’AMP extracellulaire en adénosine et phosphate inorganique, modulant ainsi la signalisation purinergique dans le microenvironnement tissulaire. En contrôlant la disponibilité locale d’adénosine, CD73 module des voies de GPCR liées à l’AMPc et influence l’activation des cellules immunitaires, la perméabilité vasculaire et les interactions plaquettes–endothélium. L’activité de CD73 contribue à la régulation de l’inflammation et des réponses associées à l’hypoxie, et elle est largement utilisée comme marqueur des états des cellules stromales et endothéliales. Une expression ou une fonction dérégulée de NT5E/CD73 a été associée à une régulation immunitaire altérée et à un remodelage tissulaire aberrant dans de multiples contextes pertinents pour la maladie.

CD73 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NT5E sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD73 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NT5E dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NT5E, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD73. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NT5E natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD73 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD73 dans les cellules tumorales présentant une expression de NT5E silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.