cathepsin D Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400207-ACT

CTSD codifica a catepsina D, uma endopeptidase aspártica lisossomal essencial para a renovação intracelular de proteínas e o processamento de antígenos através do sistema endo-lisossomal. Ao modular a proteólise mediada por lisossomos e o fluxo de autofagia–lisossomo, a catepsina D influencia a homeostase celular, as respostas ao estresse e a remodelação de substratos proteicos extracelulares e intracelulares. A expressão ou atividade desregulada de CTSD tem sido associada à neurodegeneração, inflamação e à biologia tumoral, em que a função lisossomal alterada pode afetar a apoptose, a adaptação metabólica e fenótipos invasivos. Como resultado, o CTSD é amplamente estudado em vias que governam a biogênese lisossomal, a proteostase e o tráfego endocítico.

cathepsin D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CTSD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cathepsin D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CTSD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CTSD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cathepsin D. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CTSD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cathepsin D no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cathepsin D em células tumorais com expressão de CTSD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.