CASK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401742-ACT

CASK kodiert ein membranassoziiertes Guanylatkinase-(MAGUK-)Gerüstprotein, das Multiproteinkomplexe an Synapsen und Zell-Zell-Kontakten organisiert und dabei Adhäsionsmoleküle sowie Ionenkanäle mit Signal- und Zytoskelett-Regulatoren koppelt. In menschlichen Neuronen ist CASK an synaptischem Vesikeltransport, Neurotransmission und aktivitätsabhängiger Genregulation beteiligt; seine Funktionen stehen unter anderem mit der Calcium/Calmodulin-Signalgebung und Programmen der junctionalen Polarität in Verbindung. Störungen der CASK-Dosis oder -Funktion wurden mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen assoziiert, darunter intellektuelle Beeinträchtigung, Epilepsie und Mikrozephalie, was seine Eignung als Knotenpunkt für Untersuchungen zur Synapsenassemblierung und neuronalen Reifung unterstreicht. Diese Eigenschaften machen CASK zu einem relevanten Ziel, um Signalwege zu analysieren, die neuronale Konnektivität, Erregbarkeit und gerüstproteinabhängige Signalnetzwerke steuern.

CASK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CASK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CASK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CASK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CASK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CASK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CASK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CASK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CASK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CASK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.