Calregulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400775-ACT

Das humane CALR kodiert Calreticulin, ein multifunktionales Chaperon des endoplasmatischen Retikulums (ER) und ein Ca2+-bindendes Protein mit hoher Kapazität, das die Qualitätskontrolle der Glykoproteinfaltung über den Calnexin/Calreticulin-Zyklus und ER-assoziierte Prozesse unterstützt. Calreticulin beeinflusst die intrazelluläre Calcium-Homöostase, die ER-Stress-Signalgebung und die Antigenpräsentation, indem es zum Peptid-Loading auf MHC-Klasse-I-Moleküle beiträgt, und verknüpft so Proteostase mit immunrelevanten Signalwegen. Über das ER hinaus wurde CALR mit der Regulation von Zelladhäsion und Signalübertragung in Verbindung gebracht, unter anderem über Interaktionen mit Integrinen und anderen membranassoziierten Komplexen. Eine dysregulierte CALR-Expression und -Funktion ist in Modellen von ER-Stress, immunogenem Zelltod und myeloischen Malignitäten relevanten Mechanismen bedeutsam, was seinen Einsatz in Studien zur Proteostase und entzündlichen Signalgebung unterstützt.

Calregulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CALR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calregulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CALR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CALR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calregulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CALR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calregulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calregulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CALR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.