Calpain 6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407700-ACT

Das humane CAPN6-Gen kodiert Calpain 6, ein atypisches Mitglied der Calpain-Familie mit geringer oder fehlender Proteaseaktivität, das vor allem als Regulator der Zytoskelettorganisation wirkt. Calpain 6 wird mit der Stabilisierung von Mikrotubuli, der Kontrolle der Zellform sowie der Modulation von Zellbeweglichkeit und -adhäsion in Verbindung gebracht – Prozesse, die sich mit Signalwegen überschneiden, welche Differenzierung und Gewebe-Remodelling steuern. Die CAPN6-Expression wird häufig im Kontext von Entwicklungsprogrammen und zellulären Stressantworten untersucht, bei denen Veränderungen der Zytoskelettdynamik proliferative und migratorische Phänotypen beeinflussen. Eine Fehlregulation von CAPN6 wurde in mehreren krankheitsassoziierten transkriptomischen Signaturen beschrieben, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt zur Untersuchung zytoskelettabhängigen Remodellings und aberranter Wachstumszustände unterstützt.

Calpain 6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAPN6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calpain 6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAPN6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAPN6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calpain 6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAPN6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calpain 6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calpain 6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAPN6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.