Plasmide CRISPR d'Activation (h) C9orf41: sc-409368-ACT

CARNMT1 code pour la protéine humaine C9orf41, une méthyltransférase dépendante de la S-adénosyl-L-méthionine impliquée dans le métabolisme de l’ARN via la méthylation de l’adénosine adjacente à la coiffe (Am) afin de former la N6,2′-O-diméthyladénosine (m6Am) à l’extrémité 5′ de certains transcrits. Cette modification épitranscriptomique peut influencer la stabilité des ARNm et l’efficacité de la traduction, reliant l’activité de C9orf41 à la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique et à la protéostasie. Des altérations de la méthylation associée à la coiffe de l’ARN et une dérégulation des voies de maturation/traitement de l’ARN constituent des caractéristiques récurrentes dans des jeux de données portant sur divers cancers et maladies neurologiques, faisant de CARNMT1 un nœud pertinent pour des études mécanistiques du couplage transcription–traduction. La modulation de l’expression de C9orf41 permet d’examiner comment la dynamique de m6Am façonne les transitions d’état cellulaire, les réponses au stress et des programmes d’expression génique spécifiques de certaines voies.

C9orf41 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CARNMT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

C9orf41 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CARNMT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CARNMT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de C9orf41. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CARNMT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de C9orf41 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie C9orf41 dans les cellules tumorales présentant une expression de CARNMT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.