Plasmide CRISPR d'Activation (h) C20orf54: sc-405094-ACT

SLC52A3 code pour C20orf54, un transporteur de riboflavine (vitamine B2) à haute affinité qui assure l’entrée cellulaire de la riboflavine afin de soutenir la biosynthèse du FAD et du FMN. En régulant la disponibilité des cofacteurs flaviniques, C20orf54 influence le métabolisme oxydatif mitochondrial, l’homéostasie redox et les voies dépendantes des flavoprotéines, notamment le transport d’électrons et l’oxydation des acides gras. Une activité altérée de SLC52A3 a été associée à des déficits de transport de la riboflavine et à des dysfonctionnements métaboliques et neurophysiologiques en aval, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du transport des nutriments, de la bioénergétique mitochondriale et de la signalisation des réponses au stress.

C20orf54 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC52A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

C20orf54 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC52A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC52A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de C20orf54. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC52A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de C20orf54 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie C20orf54 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC52A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.