Plasmide CRISPR d'Activation (h) Brn-3b/BRN3B/POU4F2: sc-400382-ACT

POU4F2 (Brn-3b/BRN3B) code un facteur de transcription à homéodomaine POU qui contrôle des programmes d’expression génique requis pour la spécification de la lignée neuronale, la différenciation et la survie, avec des rôles majeurs dans le développement et le maintien des cellules ganglionnaires de la rétine. Grâce à une liaison spécifique à la séquence de l’ADN, BRN3B coordonne des réseaux transcriptionnels qui influencent la croissance des neurites, le guidage axonal et les voies de réponse au stress, en s’intégrant à des signaux développementaux plus larges. Une expression ou une activité altérée de POU4F2 a été associée à des contextes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, notamment la vulnérabilité des cellules ganglionnaires rétiniennes et des pathologies liées au nerf optique, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques du destin neuronal et de la résilience.

Brn-3b/BRN3B/POU4F2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POU4F2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Brn-3b/BRN3B/POU4F2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POU4F2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POU4F2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Brn-3b/BRN3B/POU4F2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POU4F2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Brn-3b/BRN3B/POU4F2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Brn-3b/BRN3B/POU4F2 dans les cellules tumorales présentant une expression de POU4F2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.