BRCA2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400700-ACT

Das humane BRCA2 kodiert einen Tumorsuppressor, der für die hochpräzise Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch homologe Rekombination essenziell ist, indem es die Beladung von RAD51 auf resezierte DNA vermittelt und während der S-Phase Replikationsgabeln stabilisiert. BRCA2 wirkt innerhalb des Fanconi-Anämie/BRCA-Netzwerks, um DNA-Interstrangquervernetzungen zu lösen und die Checkpoint-Signalgebung zu koordinieren, um die Genomintegrität zu erhalten. Eine Störung oder verringerte BRCA2-Aktivität erhöht die chromosomale Instabilität und steigert die Anfälligkeit für Malignome, wodurch BRCA2 ein zentrales Gen in Studien zu DNA-Schadensantworten ist. Der BRCA2-Status beeinflusst zudem die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber Replikationsstress und genotoxischen Agenzien und unterstützt damit breite Anwendungen in der Forschung zu Genomerhaltung und Krebsbiologie.

BRCA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BRCA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BRCA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BRCA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BRCA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BRCA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BRCA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BRCA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BRCA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BRCA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.