BRCA1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400093-ACT

BRCA1 kodiert ein Tumorsuppressorprotein, das als zentraler Koordinator der Genomerhaltung fungiert, indem es DNA-Schäden erkennt, die Reparatur durch homologe Rekombination vermittelt und Replikationsgabeln schützt. BRCA1 ist an der Checkpoint-Kontrolle und an chromatinassoziierten Reparaturkomplexen beteiligt und integriert Signale über ATM/ATR-Signalwege, um nach Doppelstrangbrüchen die genomische Stabilität zu bewahren. Zudem trägt es zur transkriptionellen Regulation sowie zu ubiquitinvermittelten Prozessen bei, die den Zellzyklusverlauf und Stressantworten beeinflussen. Eine fehlregulierte BRCA1-Aktivität ist stark mit einer verminderten DNA-Reparaturkapazität und erhöhter genomischer Instabilität assoziiert und macht BRCA1 zu einem wichtigen Ziel für mechanistische Studien in der Krebsbiologie sowie der DNA-Reparaturforschung.

BRCA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BRCA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BRCA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BRCA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BRCA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BRCA1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BRCA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BRCA1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BRCA1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BRCA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.