BMAL1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419206-ACT

Arntl kodiert BMAL1, einen zentralen Transkriptionsfaktor der bHLH-PAS-Familie (basic helix–loop–helix PAS), der mit CLOCK ein Heterodimer bildet und so zirkadiane Genexpressionsprogramme in Mausgeweben antreibt. BMAL1 reguliert die rhythmische Transkription uhrgesteuerter Gene, die an Stoffwechsel, Zellzykluskontrolle, DNA-Schadensantworten und Immun-Signalwegen beteiligt sind, und verknüpft dabei Umweltreize mit der zellulären Physiologie. Über die Modulation transkriptioneller Rückkopplungsschleifen unter Beteiligung von PER- und CRY-Proteinen beeinflusst BMAL1 die Mitochondrienfunktion, den Umgang mit oxidativem Stress und die endokrine Homöostase. Eine dysregulierte BMAL1-Aktivität wurde in Modellen für Stoffwechselstörungen, Entzündung und Tumorbiologie mit gestörten zirkadianen Rhythmen und entsprechenden Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Eignung für mechanistische Forschung unterstreicht.

BMAL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Arntl-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BMAL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Arntl-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Arntl-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BMAL1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Arntl-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BMAL1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BMAL1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Arntl-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.