Blk CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402737-ACT

BLK kodiert die B‑lymphoide Tyrosinkinase (Blk), eine nichtrezeptorartige Kinase der Src‑Familie, die überwiegend in B‑Zellen exprimiert wird und dort den B‑Zell‑Rezeptor mit nachgeschalteten Signalnetzwerken koppelt. Blk ist an Phosphorylierungskaskaden beteiligt, die die Aktivität der PI3K‑AKT‑, MAPK/ERK‑ und NF‑κB‑Signalwege modulieren und so antigenabhängige Aktivierungsschwellen, Proliferation und Differenzierung beeinflussen. Veränderte BLK‑Expression oder regulatorische Varianten wurden mit Immundysregulation und einer erhöhten Anfälligkeit für Autoimmun‑Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch BLK ein hilfreicher Knotenpunkt für die Analyse der Signalverschaltung in B‑Zellen ist. Das humane BLK wird außerdem im Kontext der hämatopoetischen Linienbiologie und der Transkriptionsprogramme untersucht, die die B‑Zell‑Entwicklung steuern.

Blk Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BLK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Blk Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BLK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BLK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Blk-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BLK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Blk-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Blk-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BLK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.