Plasmide CRISPR d'Activation (h) BIGM103: sc-403471-ACT

SLC39A8 code pour le transporteur humain d’ions métalliques ZIP8, qui régule l’absorption cellulaire de cations divalents tels que Mn2+ et Zn2+ et soutient ainsi l’activité des métalloenzymes, la fonction mitochondriale et l’homéostasie redox. En modulant la disponibilité intracellulaire du manganèse, SLC39A8 influence la capacité de glycosylation ainsi que des réseaux plus larges de signalisation métabolique dépendant d’enzymes nécessitant le Mn2+. Une expression ou une fonction altérée de SLC39A8 a été associée à une dérégulation de l’homéostasie des métaux et à des effets en aval sur la signalisation inflammatoire et les réponses cellulaires au stress. Ces liens font de SLC39A8 (BIGM103) une cible pertinente pour des études mécanistiques du transport des métaux, de la biologie des glycannes et des perturbations de voies de signalisation dans des modèles cellulaires humains.

BIGM103 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC39A8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BIGM103 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC39A8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC39A8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BIGM103. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC39A8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BIGM103 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BIGM103 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC39A8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.