BCDO2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-413515-ACT

Das humane BCO2 kodiert die Beta-Carotin-Oxygenase 2 (BCDO2), ein mitochondriales carotinoidspaltendes Enzym, das die oxidative Spaltung von Carotinoiden und verwandten Apocarotinoiden katalysiert und dadurch das zelluläre Retinoidgleichgewicht sowie die antioxidative Homöostase beeinflusst. Durch die Begrenzung der Carotinoidakkumulation in Mitochondrien trägt BCDO2 zur Integrität der Mitochondrien, zur Regulation reaktiver Sauerstoffspezies und zu metabolischen Stressantworten bei, die mit dem Lipidstoffwechsel und der Redoxsignalgebung zusammenhängen. Eine Störung der BCO2-Expression wurde in der Literatur mit veränderter Carotinoid-/retinoidabgeleiteter Signalgebung und mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung gebracht – Prozesse, die für metabolische Phänotypen und oxidativstressassoziierte Gewebepathologien relevant sind. Diese Eigenschaften machen BCO2 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien des Carotinoidstoffwechsels, der mitochondrialen Qualitätskontrolle und kontextabhängiger transkriptioneller Programme.

BCDO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BCO2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BCDO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BCO2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BCO2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BCDO2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BCO2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BCDO2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BCDO2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BCO2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.