B7-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401971-ACT

Humanes CD80 (B7-1) ist ein kostimulatorischer Ligand der Immunglobulin-Superfamilie, der vor allem auf antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird. Dort bindet es an CD28 und CTLA-4 auf T‑Zellen und moduliert so Aktivierung, Proliferation und Zytokinproduktion. Indem B7‑1 die Bildung der immunologischen Synapse mitprägt und Signale integriert, die die TCR‑Bindung ergänzen, beeinflusst es nachgeschaltete Signalwege, welche die Effektor-Differenzierung und die periphere Toleranz steuern. Eine fehlregulierte CD80-Expression wird mit aberranter Immunaktivierung und gestörten Toleranzmechanismen in verschiedenen Autoimmun- und Entzündungserkrankungen in Verbindung gebracht; zudem wird CD80 in der Tumorimmunologie häufig als Determinante der Antigenpräsentationskapazität untersucht. In vitro dient CD80 als wichtiger Marker und funktioneller Knotenpunkt in Studien zur Reifung dendritischer Zellen, zur Polarisierung von Makrophagen und zum Priming von T‑Zellen.

B7-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD80-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

B7-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD80-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD80-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen B7-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD80-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von B7-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des B7-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD80-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.