Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP6AP1: sc-404162-ACT

ATP6AP1 code une sous-unité accessoire du complexe H+-ATPase vacuolaire (V-ATPase), qui soutient l’acidification des vésicules et des organites, indispensable au trafic endosomal, au fonctionnement lysosomal et au traitement des protéines dans la voie sécrétoire. En influençant les événements de tri et de maturation dépendants du pH, ATP6AP1 contribue au recyclage des récepteurs, au flux autophagie–lysosome et, plus largement, à la régulation de la protéostasie. Des altérations de l’activité de facteurs accessoires de la V-ATPase ont été associées à des perturbations de la glycosylation, de la fonction des cellules immunitaires et de l’homéostasie métabolique, faisant d’ATP6AP1 un point d’entrée utile pour étudier les réponses au stress des organites. ATP6AP1 humain est donc pertinent pour explorer les mécanismes reliant l’acidification vésiculaire aux réseaux de signalisation et à l’adaptation cellulaire en situation de stress.

ATP6AP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6AP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP6AP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6AP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6AP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP6AP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6AP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP6AP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP6AP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6AP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.