ATP6AP1 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404162-ACT

ATP6AP1は、液胞型H+-ATPase（V-ATPase）複合体の補助サブユニットをコードしており、エンドソーム輸送、リソソーム機能、ならびに分泌経路におけるタンパク質プロセシングに必要な小胞およびオルガネラの酸性化を支えます。pH依存的なソーティングや成熟過程に影響することで、ATP6AP1は受容体リサイクリング、オートファジー‐リソソームフラックス、そしてより広範なプロテオスタシス制御に寄与します。V-ATPaseの補助因子活性の変化は、糖鎖付加の破綻、免疫細胞機能、代謝恒常性の乱れと関連づけられており、ATP6AP1はオルガネラのストレス応答を研究する上で有用な結節点となります。そのためヒトATP6AP1は、小胞の酸性化とシグナル伝達ネットワーク、ならびにストレス下での細胞適応を結びつける機構を解明する上で重要です。

ATP6AP1 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ATP6AP1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

ATP6AP1 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ATP6AP1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はATP6AP1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性ATP6AP1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のATP6AP1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるATP6AP1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびATP6AP1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるATP6AP1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。