Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP5H: sc-403948-ACT

ATP5H code une petite sous-unité structurelle de l’ATP synthase mitochondriale (complexe V) qui soutient l’assemblage et la stabilité du secteur F0, requis pour la production d’ATP couplée au flux de protons. En contribuant à la phosphorylation oxydative, ATP5H influence l’homéostasie énergétique cellulaire, le potentiel de membrane mitochondriale et l’équilibre rédox, avec des effets en aval sur la signalisation dépendante du métabolisme et les réponses au stress. Une expression ou une fonction altérée des sous-unités de l’ATP synthase est fréquemment associée à des phénotypes de dysfonction mitochondriale, notamment une bioénergétique compromise et une sensibilité accrue au stress oxydant, des caractéristiques récurrentes dans diverses maladies neuromusculaires et métaboliques. En tant que nœud bioénergétique mitochondrial, ATP5H est pertinent pour des études sur la régulation de la chaîne respiratoire, le contrôle qualité mitochondrial et la reprogrammation métabolique dans des états cellulaires pertinents pour la maladie.

ATP5H Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP5H sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP5H Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP5H dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP5H, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP5H. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP5H natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP5H au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP5H dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP5H silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.