Plásmido CRISPR de Activación (h) ATG7: sc-400997-ACT

El ATG7 humano codifica una enzima activadora tipo E1 que es esencial para la macroautofagia, ya que cataliza reacciones de conjugación de tipo ubiquitina necesarias para la biogénesis de los autofagosomas. ATG7 activa ATG12 y proteínas de la familia LC3/ATG8 para favorecer la formación del complejo ATG12–ATG5 y la lipidación de LC3, regulando así el secuestro de carga, el control de calidad de orgánulos y la adaptación al estrés. A través de su papel central en la proteostasis, la homeostasis mitocondrial y las respuestas de detección de nutrientes, ATG7 influye en vías vinculadas a la inflamación, la neurodegeneración, la biología de las infecciones y el metabolismo tumoral. La autofagia dependiente de ATG7 desregulada se ha asociado con cambios en la supervivencia celular y la tolerancia al estrés, lo que convierte a ATG7 en un nodo ampliamente estudiado en la investigación sobre autofagia y degradación lisosomal.

ATG7 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATG7 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ATG7 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATG7 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATG7, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ATG7. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATG7 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ATG7 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ATG7 en células tumorales con expresión de ATG7 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.