Plásmido CRISPR de Activación (h) Asbt: sc-402666-ACT

El gen humano SLC10A2 codifica el transportador apical de ácidos biliares dependiente de sodio (Asbt), un simportador de membrana que media la captación activa de ácidos biliares conjugados en el íleon distal y contribuye al reciclaje enterohepático de los ácidos biliares. Al regular el tamaño del pool de ácidos biliares y la absorción intestinal, Asbt influye en la señalización de ácidos biliares–FXR, el manejo de lípidos y los programas metabólicos e inflamatorios posteriores. Las alteraciones de la actividad de SLC10A2 se asocian con fenotipos de malabsorción de ácidos biliares, diarrea y una homeostasis desregulada del colesterol y de los ácidos biliares, y se estudian con frecuencia en el contexto de la fisiología del transporte en el epitelio intestinal. Este transportador también es relevante para investigaciones sobre la señalización del eje intestino–hígado y el impacto de los ácidos biliares en procesos metabólicos asociados al microbioma.

Asbt El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC10A2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Asbt El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC10A2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC10A2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Asbt. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC10A2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Asbt en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Asbt en células tumorales con expresión de SLC10A2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.