Plásmido CRISPR de Activación (h2) Artemis: sc-405295-ACT-2

El DCLRE1C humano codifica a Artemis, una nucleasa de ADN esencial para reparar roturas de doble cadena durante la recombinación V(D)J y la unión de extremos no homólogos (NHEJ), en las que coopera con el complejo DNA-PK para abrir los extremos codificantes en horquilla y procesar terminaciones dañadas. La actividad de Artemis favorece la estabilidad del genoma y el desarrollo adecuado de los linfocitos al permitir el ensamblaje preciso de los genes de los receptores de antígeno y la resolución de lesiones complejas de ADN generadas por radiación ionizante o por estrés replicativo. Las variantes con pérdida de función en DCLRE1C se asocian con inmunodeficiencia combinada grave y radiosensibilidad, lo que resalta su papel en la intersección entre la inmunidad adaptativa y la señalización de la respuesta al daño del ADN. Los estudios de edición genética y genómica funcional dirigidos a DCLRE1C/Artemis se utilizan para modelar defectos de la vía NHEJ, analizar los requisitos de procesamiento de extremos en la reparación de roturas de doble cadena y evaluar los efectos sobre los reordenamientos cromosómicos y la formación del repertorio inmunitario en células humanas.

Artemis El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DCLRE1C sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Artemis El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DCLRE1C en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DCLRE1C, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Artemis. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DCLRE1C y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Artemis en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Artemis en células tumorales con expresión de DCLRE1C silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.