Plasmide CRISPR d'Activation (h) APRIL: sc-403150-ACT

TNFSF13 code APRIL (A Proliferation-Inducing Ligand), une cytokine de la superfamille du TNF principalement produite par les cellules myéloïdes, qui favorise la survie des lymphocytes B, la recombinaison de commutation isotypique (class-switch) et le maintien des plasmocytes. APRIL signale principalement via les récepteurs TACI (TNFRSF13B) et BCMA (TNFRSF17), en activant des programmes NF-κB et MAPK qui coordonnent les réponses anticorps et l’homéostasie immunitaire. En raison de son rôle dans la régulation de la production d’immunoglobulines et la longévité des plasmocytes, une activité d’APRIL dérégulée est associée à l’activation aberrante des lymphocytes B et à une signalisation inflammatoire observées dans divers contextes de maladies auto-immunes et lymphoprolifératives. La biologie de la voie APRIL est donc pertinente pour les études mécanistiques de l’immunité humorale, des interactions tumeur–immunité et des réseaux de signalisation induits par les cytokines.

APRIL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFSF13 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

APRIL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFSF13 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFSF13, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de APRIL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFSF13 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de APRIL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie APRIL dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFSF13 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.