Plásmido CRISPR de Activación (m2) APPL2: sc-432068-ACT-2

El gen Appl2 de ratón codifica APPL2, una proteína adaptadora endosomal que contiene dominios BAR, PH y PTB, y que conecta los endosomas tempranos positivos para Rab5 con la transducción de señales y el tráfico de membranas. APPL2 coordina la endocitosis mediada por receptores con vías posteriores, incluidas las señales de PI3K–AKT y MAPK, influyendo en la dinámica del citoesqueleto, la migración celular y las respuestas a factores de crecimiento. Las alteraciones en la señalización de la familia APPL se han asociado con la regulación metabólica, la sensibilidad a la insulina y redes de señalización relacionadas con el cáncer, lo que convierte a Appl2 en una diana relevante para estudiar el control dependiente de endosomas de la homeostasis celular. La edición génica de Appl2 en sistemas de ratón facilita el análisis mecanístico de las funciones de andamiaje endocítico, el crosstalk entre vías y las relaciones genotipo–fenotipo en investigación de biología celular y modelos de enfermedad.

APPL2 El plásmido de activación CRISPR (m2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Appl2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

APPL2 El plásmido de activación CRISPR (m2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Appl2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Appl2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de APPL2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Appl2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de APPL2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía APPL2 en células tumorales con expresión de Appl2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.