APPL1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402243-ACT

APPL1 (Adaptorprotein, das über eine PH-Domäne und einen Leucin-Zipper 1 mit Phosphotyrosin interagiert) ist ein zytosolisches endosomales Adaptorprotein, das den Membrantransport mit der Signaltransduktion nachgeschaltet an Rezeptoren wie Adiponektinrezeptoren sowie Insulin-/IGF-Signalwegen verknüpft. Durch die Bindung an Rab5 und Phosphoinositide und die Einbindung der AKT- und AMPK-Signalgebung moduliert APPL1 die Endosomendynamik, die Glukosehomöostase und zelluläre Antworten auf metabolische Signale. Die APPL1-abhängige Signalübertragung beeinflusst Proliferation, Überleben und Reaktionen auf oxidativen Stress über PI3K–AKT und verwandte Netzwerke. Eine veränderte APPL1-Expression oder -Funktion wird mit Insulinresistenz und Phänotypen des metabolischen Syndroms in Verbindung gebracht; zudem wird APPL1 häufig in Zusammenhängen untersucht, die Endozytose mit onkogener sowie kardiometabolischer Signalgebung verknüpfen.

APPL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen APPL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

APPL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des APPL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der APPL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen APPL1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native APPL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von APPL1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des APPL1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem APPL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.