Aph-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403984-ACT

Das menschliche APH1A kodiert Aph-1, eine essenzielle Scaffold‑Untereinheit des γ‑Sekretase‑Komplexes, die den Aufbau und die Stabilität der Protease unterstützt, welche für die intramembranäre Spaltung mehrerer Typ‑I‑Membranproteine verantwortlich ist. Über die γ‑Sekretase‑Aktivität trägt Aph-1 zu regulierten intramembranären Proteolyse‑Signalwegen bei, einschließlich der Prozessierung von NOTCH‑Rezeptoren und des Amyloid‑Vorläuferproteins, und beeinflusst damit Zellschicksalsentscheidungen, Differenzierungsprogramme und neuronale Signalübertragung. Störungen in Zusammensetzung oder Aktivität der γ‑Sekretase sind mit veränderter Notch‑Signalwegaktivität und amyloidogener Prozessierung verbunden und verknüpfen APH1A‑assoziierte Mechanismen mit Krebsbiologie, Neurodegeneration und entwicklungsbedingten Phänotypen. Die Expression von APH1A und die Stöchiometrie des Komplexes sind daher relevant für Studien zur Proteaseassemblierung, zum Membrantransport und zur Signaltransduktion in humanen Zellen.

Aph-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen APH1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Aph-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des APH1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der APH1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Aph-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native APH1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Aph-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Aph-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem APH1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.