ANO1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401314-ACT

ANO1 (auch als TMEM16A bekannt) kodiert einen Ca2+-aktivierten Chloridkanal, der die epitheliale Flüssigkeitssekretion, die Erregbarkeit der glatten Muskulatur in Atemwegen und Gastrointestinaltrakt sowie die Membranpotenzialdynamik in unterschiedlichen Zelltypen reguliert. Über die Kopplung an intrazelluläre Ca2+-Signale beeinflusst ANO1 den Ionentransport, die Kontrolle des Zellvolumens und Ca2+-abhängige Signalnetzwerke, die mit Programmen der Proliferation und Migration zusammenlaufen. Eine abweichende ANO1-Expression oder -Aktivität wird mit veränderten Phänotypen der epithelialen Sekretion und einer dysregulierten Erregbarkeit in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext der Tumorbiologie untersucht, wo Chloridflüsse Wachstum und invasives Verhalten modulieren können. Dadurch fungiert ANO1 als funktioneller Knotenpunkt, der Ca2+-Signalgebung mit Chloridleitfähigkeit und nachgeschalteten Veränderungen des zellulären Zustands verknüpft, die für krankheitsassoziiertes Remodeling relevant sind.

ANO1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ANO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANO1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ANO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ANO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANO1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ANO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANO1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANO1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ANO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.